Pavienių ląstelių analizės skyrius

Tyrimų kryptys

Pavienių ląstelių genotipo ir fenotipo tyrimai
Nors XXI a. laikomas genomikos technologijų amžiumi, tačiau dauguma genomikos tyrimų buvo ir yra atliekami su homogenizuotais audiniais ar ląstelių mišiniais. Dėl to nustatoma tik suvidurkinta (populiacinė) reikšmė, neatskleidžianti biologiniame mėginyje esančių tikrosios ląstelių įvairovės, jų fiziologinių ar funkcinių ypatumų. Todėl nenuostabu, kad pasaulyje vis aktualesnės tampa tokios technologijos, metodai ir tyrimai, kurie įgalina identifikuoti unikalius biologinius skirtumus pavienių ląstelių lygyje. Tokią galimybę suteikia mikroskysčių technologija. Atsiradusi prieš keletą metų ji sukėlė tikrą proveržį biologijos ir biomedicinos tyrimuose – dėl jos tapo įmanoma analizuoti ne dešimtis, bet tūkstančius pavienių ląstelių. Mūsų mokslininkų grupė kuria naujas mikroskysčių platformas, įgalinančias atlikti genotipo-fenotipo tyrimus su tūkstančiais ar milijonu pavienių ląstelių. Tai itin aktualu biotechnologijų ir biomedicinos sektoriams. Siekiame geriau suprasti, kaip genotipas veikia ląstelių fenotipą, nustatyti biologinius ir fizikinius faktorius, nulemenčius ląstelių įvairovės susidarymą, jų atsaką vaistams ar ligos vystymąsi.

Monokloninių antikūnų paieška pavienėse B-ląstelėse
Šių tyrimų tikslas – išvystyti technologiją, leidžiančią atlikti antikūnų specifiškumo ir antikūnus koduojančių genų analizę pavienėse B-ląstelėse. Pagrindinė idėja paremta tuo, kad mikroskopiniuose lašeliuose izoliavus imunines ląsteles kartu su rutuliukais, gebančiais surišti a) sekretuojamus antikūnus ir b) ląstelių iRNR, galėsime identifikuoti genų sekas, koduojančias specifinius monokloninius antikūnus ar kitus terapeutinius baltymus. Šie tyrimai galėtų būti svarbūs reikšmę taikomiesiems biologijos mokslams, biotechnologijai ir biomedicinai, nes leis atlikti terapinių antikūnų paiešką pirminėse B-ląstelėse ir juos koduojančių genų sekoskaitą, sudarys naują technologinį pagrindą imuninės sistemos tyrimams.

Pavienių ląstelių transkriptomika 
Pavienių ląstelių DNR ir RNR sekoskaita ir analizė yra viena iš sparčiausiai augančių technologinių šakų, radančių vis platesnį pritaikymą įvairiose biologijos mokslo šakose ir biomedicinoje. Pasinaudodami mikroskysčių technologijos teikiamais privalumais, kartu su bendradarbiais iš Harvardo universiteto sukūrėme unikalią pavienių ląstelių transkriptomikos sekoskaitos ir analizės metodiką. Šis metodas paremtas ląstelių enkapsuliacija į nanolitro tūrio lašelius kartu su barkoduojančiais DNR pradmenimis bei fermentinės reakcijos komponentais, skirtais RNR padauginimui. Enkapsuliacijos metu užtikrinamos sąlygos, kad į vieną lašelį statistiškai papuola viena ląstelė ir viena hidrogelio dalelė; pastarosios paviršius padengtas barkoduotomis DNR molekulėmis. Į tą patį lašelį patekus hidrogelio dalelei ir ląstelei, pastaroji lizuojama, o išsiskyrusios informacinės RNR molekulės pažymimos unikaliu barkodu vykdant atvirkštinės transkripcijos reakciją. Panaudodami šią metodiką atlikome fundamentinius embrioninių ląstelių vystymosi tyrimus skirtingomis biologinėmis sąlygomis ir parodėme, kad ši technologija leidžia labai tiksliai nustatyti heterogeninių populiacijų struktūrą, identifikuoti naujus ląstelių tipus, atkurti kiekvienos ląstelėje esančios genų raiškos tinklus (Klein, Mazutis et al., Cell, 2015).

Kryptinga baltymų evoliucija
Didelė baltymų ir fermentų, aptinkamų gyvuosiuose organizmuose, įvairovė atsirado Č. Darwino evoliucijos proceso metu. Vykstant pakartotiniams mutacijų, atrankos ir padauginimo ciklams, fermentai tapo ypač efektyvūs biokatalizatoriai, atliekantys pačias įvairiausias funkcijas žymiai veiksmingiau nei tie katalizatoriai, kuriuos kada nors yra sukūręs žmogus. Be to, natūralių fermentų katalitiniai centrai yra labai sudėtingos organizacijos. Tai apsunkina baltymų evoliucijos supratimą ir nespecifinio katalitinio aktyvumo atsiradimą naujai įgytose baltymų funkcijose. Šiuose tyrimuose naudojamės pažangiomis mikroskysčių technologijomis, kurios leidžia atlikti kryptingą baltymų evoliuciją griežtai kontroliuojamomis sąlygomis, sunkiai pasiekiamomis įprastiniais metodais. Pritaikydami mikroskysčių technologijas, kurioms padedant produkuojami monodispersiniai lašeliai, sukuriame „dirbtines ląsteles“, kurios geba atlikti in vitro genų ekspresiją ir parinkti tokias fermentų atrankos sąlygas, kurios būtų nesuderinamos su in vivo sistemomis. Tikimės, kad mūsų inovatyvus eksperimentinis priėjimas prie šiuolaikinių baltymų evoliucijos problemų leis geriau suvokti fermentų katalizės principus ir naujų katalitinių funkcijų atsiradimą, taip suteikdamas naujų ir vertingų fundamentinių žinių.

Mikroskysčių technologijos biologijoje ir biomedicinoje
Lašeliais peremta mikroskysčių technologija suteikia unikalias galimybes manipuliuoti įvairiomis biocheminėmis ir biologinėmis reakcijomis jas įdedant į piko- arba nano-litro lašelius. Kaip ir gamtoje, kur dauguma reakcijų yra kompartmentalizuojamos padedant ląstelėms (arba į dar mažesnius organoidus), taip ir į žmogaus sukurti lašelius galima žvelgti kaip į atskirus mikrokompartmentus (mėgintuvėlius, šulinėlius, kolbeles), įgalinančius vienu metu atlikti ypač daug biocheminių reakcijų. Mikrolašeliai gali būti generuojami ir manipuliuojami labai sudėtingais, bet gerai kontroliuojamais būdais, ko neįmanoma atlikti įprastiniais metodais. Itin monodispersiški vandeniniai mikrolašeliai (<1 proc. polidispersiškumo) gali būti generuojami per 20.000 s-1 greičiu sukuriant įvairaus tipo emulsijas. Dėl mikroskysčių technologijos vandeniniai mikrolašeliai gali būti sulieti, padalinti, jų turinys efektyviai sumaišytas, inkubuojami ir sortiruojami. Įvairių fermentinių reakcijų kinetika gali būti nustatyta matuojant fluorescenciją skirtinguose kanalėlių vietose atitinkančius skirtingus inkubavimo laikus (nuo ms iki val). Išlieka didelis poreikis tokių miniatiūrizuotų sistemų, kurios galėtų atlikti integruoti daugiapakopes operacijas su minimaliais mėginio kiekiais ir atlikti įvairias analizes su padidintu našumu ir minimalia žmogaus intervencija. Tokie miniatiūrizuoti įtaisai suteiktų galimybes atlikti tikslius matavimus itin dideliu našumu, pašalintų potencialių klaidų ir intensyvaus darbo laboratorijoje būtinybę. Be to, dėl sumažėjusių reakcijų tūrių tokie įtaisai sumažintų sąnaudų dydį. Visiškai integruotos mikroskysčių sistemos sujungs daugumą darbų ir operacijų, atliekamų įprastoje biochemijos laboratorijoje, į vieną, funkcionalų įtaisą arba mikrogardelę.